iptg诱导原理

Toll样受体（TLR）是的一种重要蛋白质，可辨识并对外源性微生物产生反应，激发一系列信号转导过程，从而释放炎性介质，激活天然免疫反应。至今发现的TLR家族成员已经超过十个，其中TLR2是表达范围最广、能够识别多种病原微生物及其产物的分子之一。它广泛存在于单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞以及上皮细胞和细胞中。鉴于TLR2在天然免疫中的关键作用，对其深入研究具有深远的理论意义和现实意义。

Cloud-Clone Corp.公司针对这一蛋白，开发了包括重组蛋白、抗体和ELISA检测试剂盒在内的多种检测工具，为研究者提供了极大的便利。

通过精确的蛋白结构分析，我们了解到TLR2是一个I型跨膜蛋白，其结构分为胞外段、跨膜段和胞内段。TLR2的胞外区域含有19个LRR（Leucine-rich repeats）重复区域。通过抗原表位分析、蛋白结构预测及蛋白可溶性分析，我们选定了Pro47-Gly245片段作为TLR2的表达片段，这是胞外区域的一部分，为需要研究此蛋白的研究者提供了便利。

依据NCBI中NM_003264.3的CDS（编码TLR的核酸序列）设计引物，考虑到序列中的EcoRI酶切位点，我们在上下游引物中分别设计了BamHI和Xhol酶切位点，以利于后续重组载体的构建。经过PCR技术扩增，我们成功获得了长度为600bp的DN段。测序验证无误后，我们使用双酶切技术将此片段与Cloud-Clone Corp.公司自主构建的大肠杆菌表达载体pUSCNK-1连接，成功构建了表达质粒。

测序结果（如图1所示）显示，我们的序列与NCBI中TLR2的基因序列完全一致，相似性达到100%，这进一步证实了我们的扩增序列是正确的。

通过IPTG诱导，我们在体外表达了重组蛋白，得到了一个大小约为29KD的重组蛋白。此蛋有His标签，便于后续的纯化操作。我们采用镍柱纯化法，成功获得了高纯度的重组蛋白TLR2（货号RPA663Hu01），其凝胶电泳图如图4所示。

利用纯化得到的重组蛋白，我们免疫了小鼠，成功获得了小鼠抗人TLR2的单克隆抗体，并进一步通过亲和层析法得到了高特异性的纯化抗体（MAA663Hu21）。我们也制备了兔抗人TLR2的多克隆抗体（PAA663Hu01）。

经过Western Blot等一系验证实验后（图5、图6），我们证实了抗人TLR2抗体的高特异性。在IHC验证中，我们发现在人中存在强阳，主要集中于细胞膜上。这进一步证明了我们的抗体在实验中的有效性及实用性。