琼脂糖凝胶电泳的原理

原理概览

将待测的DNA分子经由或不经过限制性内切酶的处理，使用琼脂糖凝胶电泳技术进行分离。之后，将DNA变性并根据其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上。在固定之后，利用同位素或其他标记的DNA或RNA探针与其进行反应。当待测样本中存在与探针互补的序列时，二者会依据碱基互补的原则结合。经过游离探针的洗涤及自显影或其他检测技术的运用，最终呈现出待测的DN段及其相对大小。

应用详解

该技术被广泛应用于检测样品中的DNA及其含量，有助于了解基因的状态，如点突变、扩增重排等情况。

实验所需试剂与器材

试剂清单

变性液：包含1.5mol/L的NaCl和0.5mol/L的NaOH。

中和液：由0.5mol/L的Tris-HCl（pH=7.0）和1.5mol/L的NaCl组成。

不同浓度的SSC溶液（20×SSC、2×SSC和6×SSC），均在经过100Kpa灭菌20分钟后使用。

器材需求

22cm×15cm瓷盘用于琼脂糖凝胶电泳过程中DNA的电泳分离。

详细操作步骤涉及在凝胶上执行电泳、变性、中和及转移等步骤，包括切去凝胶边缘的多余部分、EB染色及紫外灯下照相，以测定DNA迁移的距离。

具体操作还包括将凝胶浸泡在变性液中振荡，使ds-DNA转变为ss-DNA，随后用重蒸水冲洗凝胶。

还有中和液的使用，要振荡并确保凝胶呈中性状态，以防止硝酸纤维膜受损。

涉及使用不同浓度的SSC溶液进行转移滤液操作，以及使用滤纸、吸水纸、玻璃板和重物等辅助器材进行转移过程的固定和加压。

注意事项提示

在将凝胶中和至中性时，需测量其pH值，以防止凝胶的碱性硝酸纤维膜。

在操作过程中，需特别注意赶走凝胶、滤纸及硝酸纤维素膜之间的气泡。

SDS-PAGE电泳注意事项

SDS与蛋白质的结合需按质量成比例，若蛋白质含量超标，则SDS结合量不足（即每克蛋白质需有1.4g SDS）。

进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质相对分子量时，必须同时制作标准曲线，且不可重复利用旧的标准曲线。由于SDS-PAGE存在约10%的误差率，因此不可完全依赖该方法得出的结果。

对于由亚基（如血红蛋白）或多条肽链（如α-胰凝乳蛋白酶）组成的蛋白质，它们在巯基乙醇和SDS的作用下会解离成亚基或多条单肽链。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定的只是这些亚基或单条肽链的相对分子量。

某些特殊蛋白质（如电荷异常或结构异常的蛋白质；带有较大辅基的蛋白质）不适合使用该方法测定相对分子量。

如果在电泳过程现拖尾、染色带背景不清晰等现象，可能是SDS不纯所导致。

实验结束

以上即为DNA检测及SDS-PAGE电泳的相关流程与注意事项。请按照步骤仔细操作，确保实验的准确性与可靠性。