杂乱无章是什么意思是什么

对于荧光定量PCR的结果判断，最直观的方式是观察扩增曲线。当遇到异常扩增曲线时，我们会结合几个实例，带大家了解常见的异常扩增曲线的分析。

一、正常PCR扩增曲线

随着实验的进行，扩增产物逐渐累积，相应的荧光信号也不断增强。每当完成一个循环，就会采集一次荧光信号。经过一定的循环数后（例如40个循环），我们可以得到扩增曲线图。横坐标代表循环数，纵坐标代表荧光的强度。

我们需要明确一些基本概念：

1. 基线：在PCR扩增反应的初始阶段，荧光信号变化不大，近似为一条直线，这条线就是基线。

2. 阈值线：通常，前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号。阈值的设定是本底信号标准差的10倍，在PCR扩增的指数期。

许多仪器可以自动设定阈值线，满足我们的实验需求，无需手动设置。

3. CT值：我们常用CT值来计算相对含量，即扩增产物的荧光信号到达设定的阈值线时所经历的扩增循环数。

二、标准曲线

标准曲线用于确定未知样品的初始量，如果需要绝对定量，必须有标准曲线。

每个模板的CT值与该模板的起始拷贝数的对数是存在线的。起始拷贝数越大，CT值越小。制作标准曲线时，需要将标准品按照一定倍数稀释5-6个浓度左右，然后根据RT-PCR的反应条件进行反应。以标准品拷贝数的对数值为横坐标，CT值为纵坐标，绘制线性曲线。未知样品的拷贝数可根据曲线方程计算得出。

至于标准曲线的标准品如何确定，如果做绝对定量，标准品的要求较高，制备过程也相对复杂，但结果更精确。它必须是准确量化的、标准化的、稳定的质粒DNA（也可以是基因组DNA、纯化后的PCR产物等）。PCR反应仪器要统一，并且操作条件要一致，包括反应体系、参数等。

三、熔解曲线

熔解曲线主要是考察染料标记法结果的特异性。简单来说，就是确定你的引物是否有效。如果反应产物单一，曲线会出现一个尖锐的峰；如果出现二聚体或非特异性扩增，就会出现至少两个峰或更糟糕的情况。使用SYBR Green染料时，必须做熔解曲线，因为这是一个非特异性的染料。

在实验过程中，可能会遇到很多问题，以下是几个常见的问题及解决方案：

1. 扩增曲线在40个循环后没有平台期，或者根本无法呈现指数上升？这种情况可能是因为起始模板浓度过低，即使经过40个循环也无法达到平台期。可以通过增加循环数来验证这个问题。

2. 熔解曲线有问题，比如多个峰、尖锐峰前面有个小峰、没有峰？这可能与引物以及反应体系温度有关。如果没有峰值或者曲线杂乱无章，很可能是引物的问题，建议重新设计引物。有时小的峰可以通过优化反应条件，如退火温度的优化来消除这个影响。

接下来我们详细解析一些常见的异常扩增曲线：

一、确认软件设置是否正确 对照试剂盒说明书检查时间、温度、循环数以及荧光采集等设置是否正确。容易忽略的一点是检查所选试剂中是否含有ROX作为参比荧光染料。

二、确定耗材及仪器配件是否使用正确 耗材对于荧光定量PCR来说非常重要很多异常的扩增曲线是由于耗材使用不当引起的。常见的耗材问题包括： （一）错误使用成普通PCR仪器所对应的耗材 普通PCR耗材一般透光度比较差会造成荧光扩增曲线异常比如打折的扩增曲线 （二）未选择跟仪器加热模块规格匹配的耗材 荧光定量PCR仪加热模块分0.2ml跟0.1ml两种如果使用不当会导致一系列问题比如反应管的外壁和荧光定量PCR仪器的温控模块没有充分接触从而出现热传导不充分进而影响酶的活性会引起重复性不好或者溶解曲线多峰（非特异扩增）甚至是假阴性结果 （三）使用了质量比较差的耗材 目前市面上荧光定量PCR耗材种类繁多质量也是良莠不齐在耗材选择上尽量选择质量品牌好一点的否则会引起一系列问题造成不必要的浪费 比如质量不好的耗材可能会引起荧光值不稳定这会造成反应孔的自动基线扣除错误得到不准确的CT值更换质量好的耗材后荧光信号恢复正常 此外如果使用的PCR反应板封膜质量不好在PCR过程中受到水蒸气的影响容易变形这样会引起optical warping现象即光学扭曲现象该实验中由于使用了ROX作为参比染料ROX有效的校正了这种荧光信号的变化均一化的扩增图结果是正常的 除了耗材外跟仪器配套使用的配件也要检查是否使用正确比如配套的8联管托架在使用的时候只使用了托架的下半部分如果忘记把上半部分取下有可能会影响扩增 除了以上提到的耗材和配件问题还有一些其他常见的问题也会导致异常扩增曲线比如试剂问题实验设置问题等 在确认软件设置耗材及仪器配件都正常使用后如果